En relación con una época en que los gobiernos establecidos consideraban la unidad de la fe religiosa como base de su política, el tribunal del Santo Oficio, que gozaba en España de un poder que ni siquiera se detenía ante los miembros de la familia real, fue encargado en América de la policía de costumbres, de reprimir los extravíos de una mística irrefrenada, de extirpar todo retoño del islamismo y del judaísmo, que habían sido eliminados de la metrópoli, y de impedir la entrada del protestantismo en las nuevas tierras. Su instalación en América no fue inmediata a la conquista; Jiménez de Cisneros dio ciertos poderes inquisitoriales a los obispos de Indias en 1517, cuando le fueron denunciados crímenes y delitos de herejía y de apostasía, pero la inquisición peninsular se negaba a delegar sus facultades y pedía que le fuesen remitidos los reos desde las Antillas. La primera designación legal fue la hecha por el inquisidor Adriano en favor del obispo de Puerto Rico, Alonso Manso, en 1519.
En tiempos del arzobispo Zumárraga(1527-1548) se celebraron autos de fe en México, con 131 procesos(13 contra indios); en uno se reconcilió Andrés Marván, acusado de luteranismo; en otro se reconcilió el judaizante Francisco Millán, y en otro fue condenado el cacique de Tezcoco, Carlos Chichicatécotl, acusado de sacrificios humanos a los dioses aztecas. La muerte del cacique de Tezcoco preocupó al inquisidor general en España, que ordenó una revisión del proceso, y fray Zumárraga recibió advertencias sobre el trato a los indios, contra los cuales se procedió desde entonces con más benignidad, hasta excluirles luego enteramente "por ser nuevos en la fe, gente flaca y de poca sustancia". En tiempos del obispo Montúfar, sucesor de Zumárraga, a mediados del siglo XVI, un italiano fue reconciliado por luteranismo, María de Ocampo por pacto con el demonio, Roberto Thompson condenado a tres años de sambenito por luteranismo, etcétera.
Las Cédulas de Felipe II autorizando el establecimiento del Santo Oficio en América fueron firmadas a principios de 1569 y a mediados de 1570. A fines del siglo XVII comenzó la declinación de este organismo; su actividad se amortiguó en el XVIII, y fue suprimido a principios del siglo XIX.
Según José Toribio Medina, del análisis de unas 1.500 causas juzgadas por el Santo Oficio en América, se especifican los siguientes casos: 243 por judaizantes, 5 por moriscos, 65 por protestantes, 298 por bígamos, 40 por aberraciones sexuales, 140 por herejía, 97 por blasfemia, y 172 por brujería.
El Santo Oficio tuvo tres centros en América: el de México, el de Lima y el de Cartagena(Colombia). En México comenzó a funcionar el tribunal de la Inquisición en noviembre de 1570. Los primeros procesos fueron hechos a extranjeros acusados de luteranismo. De 30 ingleses pertenecientes a la expedición de Juan Hawkins, dos o tres fueron quemados, otros condenados a azotes y siete a servir en conventos; y en el siglo XVI y comienzos del XVII hubo unos 30 juicios contra luteranos y calvinistas. El 28 de febrero de 1574 hubo un gran auto de fe con la presentación de 74 reos, de ellos 36 luteranos; el 8 de diciembre de 1596 los penitenciados sumaban 66, de los que se reconciliaron 22 judaizantes, y fueron quemados nueve en persona y diez en efigie; el 26 de marzo de 1601 fueron presentados 124 penitenciados, cincuenta de ellos judaizantes; se quemó a 10 en efigie y a cuatro en persona; y el más aparatoso de los autos de fe, culminación del período más activo de la Inquisición en Nueva España, fue el del 11 de abril de 1649, con 109 penitenciados y 13 relajados en persona, de los cuales sólo uno murió en la hoguera, Tomás Tremiño de Sobremonte. En 1659 hubo 7 relajados, uno en 1678, uno en 1699, y uno dudoso en 1715. No todos los relajados iban a la hoguera; a algunos, por circunstancias atenuantes, se les daba garrote, instrumento usado para los condenados a muerte.
En Lima se estableció el Santo Oficio en 1570, meses antes que en México. El tribunal limeño organizó vastas redadas contra los protestantes y los portugueses acusados de judaísmo; en 1581 procedió contra Juan Oxemham; Enrique Oxley fue quemado el 5 de abril de 1592; los hermanos Tiller fueron salvados de las llamas y ejecutados por garrote; nueve de los doce marinos de Tomás Cavendish, capturados en Chile, fueron colgados; los restantes se reconciliaron. En la persecución contra los judaizantes portugueses murió en las llamas, el 23 de enero de 1639, el médico de Concepción (Chile), Maldonado Silva, y el acaudalado Manuel Bautista Pérez corrió la misma suerte; en 1688 fue abierto proceso a la revelandera Angela Carranza, de Tucumán, condenada a la reclusión en un convento. Durante los 230 años que funcionó la Inquisición en Lima sólo hubo 30 relajados, y de ellos no murieron en las llamas más que 15. Chile y Buenos Aires estaban sujetos a la jurisdicción del Santo Oficio limeño.
Del tribunal de Cartagena dependían los arzobispados de Santa Fe y de Santo Domingo, y los obispados de Cartagena, Panamá, Santa Marta, Popayán, Venezuela, Puerto Rico y Santiago de Cuba. Comenzó sus tareas en 1611 y tuco menos oportunidad de destacar su actividad que los de México y Lima; entendió generalmente en causas de brujería, blasfemia y bigamia, y los autos graves, como el que llevó a la hoguera al inglés Adán Haydon, fueron muy raros. La población colonial protestó con frecuencia de los procedimientos del Santo Oficio, y por otra parte las autoridades y el clero se quejaban de su ineficacia.
La extensión enorme de los territorios comprendidos en las jurisdicciones de los tres tribunales del Santo Oficio hizo que las causas demorasen a veces muchos años y entre tanto los acusados tenían que permanecer en las prisiones de la Inquisición. En la época del enciclopedismo y de librepensamiento, el Santo Oficio habría encontrado amplio campo de acción, pero cuando esa ideas penetraron en América por los más diversos caminos, la Inquisición había perdido su omnipotencia y sus intervenciones se volvieron cada vez más raras. Se destacó en sus últimos años como instrumento de dominación política.